メタバーコーディングプライマー

環境DNAで使われているメタバーコーディングプライマーを中心にまとめました。基本的にMi ~と名の付くプライマーはMiseqの150PEで解読できるようになっているそうです。

Note
プライマー配列は一度Primer Blastして期待する分類群を増幅するか・期待しない分類群を増幅しないか、組織を用いた実験などをして挙動は事前確認しましょう。

多様性検出

魚類 (Osteichthyes, Chondrichthyes, Cyclostomata)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
MiFish-U-F(硬骨魚類)	GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC	Miya et al. 2015
MiFish-U-R (硬骨魚類)	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	同上
MiFish-Ev2-F(軟骨魚類)	RGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC	環境DNAマニュアル v3.0.1
MiFish-Ev2-R(軟骨魚類)	GCATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG	同上
MiFish-U2-F(アナハゼ類)	GCCGGTAAAACTCGTGCCAGC	同上
MiFish-U2-R(アナハゼ類)	CATAGGAGGGTGTCTAATCCCCGTTTG	同上
MiFish-L-F(ヤツメウナギ類)	GCTGGTAAACCTCGTGCCAGC	環境DNA手順書
MiFish-L-R(ヤツメウナギ類)	CATAGCGGGGTATCTAATCCCGGTTTG	同上

海域調査では MiFish-U と Ev2 を、アナハゼ類が想定される場合は U2 を混合して使用する。ヤツメウナギなどの円口類が生息する場合は、MiFish-L も併用する。

U・Ev2・U2 を混合する場合は、環境DNAマニュアル（5-2-1-1「1st PCR」）を参考に 2:1:1 の比率で混合する。

また、アユ (Plecoglossus altivelis altivelis)では、バイオマスとメタバーコーディング結果が一致しないとの報告がしばしば見られる。

これは、プライマー結合部位に存在する数塩基のミスマッチが影響している可能性があり、アユ特異的プライマーを追加する選択肢も検討に値する。

甲殻類 (Decapoda)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
MiDeca-F	GGACGATAAGACCCTATAAA	Komai et al.2019
MiDeca-R	ACGCTGTTATCCCTAAAGT	同上

甲殻類というよりも十脚目に特化したユニバーサルプライマーである。現状の参照データベースでは、メタバーコーディング解析において種レベルまで同定できない配列が多い印象がある。

ただし、令和２年度戦略的研究開発課題において無脊椎動物の基盤データ整備が明記されていたので、データベース拡充に伴う検出精度と解像度の向上が期待される。

哺乳類 (Mammalia)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
MiMammal-U-F	GGGTTGGTAAATTTCGTGCCAGC	Ushio et al.2016
MiMammal-U-R	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	同上
MiMammal-E-F(象)	GGACTGGTCAATTTCGTGCCAGC	同上
MiMammal-E-R(象)	CATAGTGAGGTATCTAATCTCAGTTTG	同上
MiMammal-B-F(熊)	GGGTTGGTTAATTTCGTGCCAGC	同上
MiMammal-B-R(熊)	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	同上

陸上に生息する哺乳類を水試料から検出するアプローチである。近年では夜行性哺乳類であるカワネズミ (Chimarrogale platycephalus) の検出などにも応用されている。

一方で、ヒトDNAのコンタミネーションが起こりやすいため、採水・実験操作時には特に厳密な管理が求められる。

鳥類 (Aves, Bird)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
MiBird-U-F	GGGTTGGTAAATCTTGTGCCAGC	Ushio et al.2018
MiBird-U-R	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	同上

超可変領域長: 約171bp

水鳥など、水域利用頻度の高い鳥類相の調査に用いられる。鳥類DNAが少ない条件では、ヒトや魚類DNAが相対的に増加する傾向がある。

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
BirT-F	YGGTAAATCYTGTGCCAGC	Thalinger eta. 2023 preprint
BirT-R	AAGTCCTTAGAGTTTYAAGCGTT	同上

超可変領域長: 約276 (319-43) bp

プレプリント段階の研究であり、実運用での性能評価は今後の検証が必要だが、増幅特性は比較的良好との印象がある。

水棲昆虫 (Insecta, Water invertebrate)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
LCO1490	GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG	Folmer et al.1994, Uchida et al.2020
HCO2198	TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA	同上

Illumina シーケンサーでは 600 cycle（300 bp PE）以上のカートリッジが必要

Uchida et al. (2020) に記載の LCO1490–HCO2198 は MiSeq の可読長を超えるため、一般的に用いられているIlluminaシーケンサーのPaired-EndシーケンスではForward/Reverse のマージができない点に注意。
Uchida et al.(2020)のLCO1490はFolmer et al. (1994) と配列が異なるため、使用前に必ず原著論文を確認することを推奨する。

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
fwhF2	GGDACWGGWTGAACWGTWTAYCCHCC	Vamos et al2017
EPTDr2n	CAAACAAATARDGGTATTCGDTY	Leese et al.2020

Illumina シーケンサーでは 300 cycle（150 bp PE）以上のカートリッジで解析可能

fwhF2–EPTDr2n プライマーセットは、日本で使用する場合、目的とする分類群が十分に増幅されるか事前検証を行うことを強く推奨する。

EPTDは以下の分類群の略称である。

Ephemeroptera（カゲロウ目）
Plecoptera（カワゲラ目）
Trichoptera（トビケラ目）
Diptera（ハエ目）

過去の検証では、カゲロウ目やユスリカ（Diptera）が優先的に検出される傾向が確認されている。

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
MtInsects-16S_F	GGACGAGAAGACCCTWTAGA	Takenaka et al.2023 (開発論文), Takenaka et al.2024 (環境DNA適用)
MtInsects-16S_R	ATCCAACATCGAGGTCGCAA	同上

Illuminaシーケンサーなら300cycle (150PE) の以上のカートリッジでシーケンス

対象分類群が昆虫であるため、同一地点でfwhF2–EPTDr2nと並列して使用すると、異なる水棲昆虫相が得られる。現状では両者を併用する運用が推奨される。
オイカワ (Zacco platypus) が非特異的に増幅される点に注意する。

なお、どちらのバーコーディングプライマーでもトンボ目（Odonata）は増幅されにくい傾向がある。

京都大学プレスリリース: https://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research-news/2023-01-20-9

サンショウウオ属 (Hynobius)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
Hynobius_12S_F1	TTAATAAAAACGGCCTAAAGCGTG	Sakai_et_al.2019
Hynobius_12S_R1	TCAATTATAGAACAGGCTCCTCTAGGG	同上

Illuminaシーケンサーなら500cycleの以上のカートリッジでシーケンス

ウナギ属 (Anguilla)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
MiEel-F	CTTACAGCAAACCTGACAGCAG	Takeuchi et al.2019
MiEel-R	TTGGTGTGCCATTATACGTTTTCTTG	同上

両生類 (Amphibia)

プライマー名	配列(5’→3')	出典
Amph_16S_1070F	ACGAGAAGACCCYRTGGARCTT	Sakata et al.2022
Amph_16S_1340R	ATCCAACATCGAGGTCGTAA	同上

Illuminaシーケンサーなら500cycleの以上のカートリッジでシーケンス

論文中のプライマー作成の部分に、InSilicoで魚類・哺乳類・鳥類の増幅が考えられる旨の記載がある。両生類以外の生物種が同所的に生息しておりバイオマス量の偏りが大きい場合には、データ量を多く取得しないとバイオマス量の少ない両生類が検出されない可能性あり。

クモヒトデ綱 (Ophiuroidea : 16SOph1, Echinodermata : 16SOph2)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
16SOph1-F	GTACTCTGACYGTGCAAAGGTAGC	Okanishi et al.2023
16SOph1-R	TAGGGACAACACGTCCCRCT	同上
16SOph2-F	GGACGAGAAGACCCYRTWGAG	同上
16SOph2-R	CAACATCGAGGTCGCAAAC	同上

Illuminaシーケンサーなら300cycleの以上のカートリッジでシーケンス

イシサンゴ目 (Scleractinian)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
Scle_12S_Fw	CCAGCMGACGCGGTRANACTTA	Shinzato et al.2021 (開発), Nishitsuji etal.2023 (実証研究)
Scle_12S_Rv	AAWTTGACGACGGCCATGC	同上

産物長 366~465bpなので、Illuminaシーケンサーなら600cycleのカートリッジでシーケンス

八放珊瑚亜綱 (Octocorals)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
Anth-28S-eDNA-F	CGTGAAACCGYTRRAAGGG	McCartin et al.2024(原著) / Takata et al.2025 (データベース拡充)
Anth-28S-eDNA-R	TTGGTCCGTGTTTCAAGACG	同上

Illuminaシーケンサーなら300cycleの以上のカートリッジでシーケンスすると可変長でも十分な配列が得られるらしい

頭足類

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
Cep16S_D_F	公開情報なし	Wu et al.2025
Cep16S_D_R	公開情報なし	同上
Cep16S_O_F	公開情報なし	同上
Cep16S_O_R	公開情報なし	同上

Cep16S_Dは最頻274–289 bp (対象 264–324 bp),

ハプロタイプ検出用プライマー

特定の種内多型を環境DNA分析で検出するためのプライマーセット

アユ (Plecoglossus altivelis altivelis)

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
PaaDlp-2_F	CCGGTTGCATATATGGACCTATTAC	Tsuji et al.2020 (開発) / Tusji et al.2023 (実証研究)
PaaDlp-2_R	GCTATTRTAGTCTGGTAACGCAAG	同上

増幅領域長は215bpなので、Illuminaシーケンサーなら150PE 300cycle以上のカートリッジでシーケンス。対処領域はmtDNA D-loop

系統地理

ドンコ属 (Odontobutis obscura, O. hikimius)

既存のドンコ2種を含む複数系統を増幅するプライマー

プライマー名	配列 (5’→3')	出典
Odon_12S primer-F	TATACGAGAGGCTCAAGCTGAT	Tsuji etal.2023 (原著) / 紅
Odon_12S primer-R	GTTTTACCAGTTTTGCTTACTATGG	同上

増幅領域長は370bpなので、Illuminaシーケンサーなら250PE 500cycle以上のカートリッジでシーケンス。対処領域はmtDNA 12s rRNA

カワムツ, ヌマムツ, オイカワ (Nipponocypris temminckii, N. sieboldii, Zacco platypus)

オイカワ, カワムツ, ヌマムツの系統を増幅するプライマー (ハスが増えるので注意)

プライマー名	配列(5’→3')	出典
NipZac_D-loop primer-F	ACTATCTTCTGATAGTAACCTATATGGTA	Tsuji etal.2023 (原著) / 紅
NipZac_D-loop primer-R	GTGTCCCTGATTCTATCATGAATAG	同上

増幅領域長は270bpなので、Illuminaシーケンサーなら250PE 500cycle以上のカートリッジでシーケンス。対処領域はmtDNA D-loop

※ Opsariichthys uncirostris を増幅する点に注意

ヨシノボリ属 (Rhinogobius)

プライマー名	配列(5’→3')	出典
公開情報なし	公開情報なし	Tsuji etal.2025 (原著)
公開情報なし	公開情報なし	同上

本州を中心に生息するヨシノボリ全種の系統地理解析用プライマー

フクドジョウ (Barbatula toni / B.oreas)

プライマー名	配列(5’→3')	出典
公開情報なし	公開情報なし	Tsuji etal.2025 (原著)
公開情報なし	公開情報なし	同上

おおよそ266bpの増幅領域を持つ、cytb領域を増幅するプライマー

プライマー名	配列(5’→3')	出典
Bto_Cytb-F	TGAAACTTCGGATCACTCCTGG	Tsuji etal.2025 (プレプリント)
Bto_Cytb-R	TACTAGGGCAAGCTCATTCTAGC	同上
Bto_ND5-F	GTCACCAACTGGCACTGGA	同上
Bto_ND5-R	CATCTTTTGAAAAGAAGCCTGCAAG	同上

産物長約1000bpのNanopore plasmidシーケンスにて解析することを前提に構築されたプライマー

プライマーの確認等に使うもの

Primer blast
Reverse complement
(混合塩基が含まれているプライマーはこちらで実行)
混合塩基確認
解像度確認
簡単なTmの確認

プライマーが対象分類群・種のDNAを増幅するかの確認

rDoAMP(https://github.com/ong8181/rDoAMP)

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